'S e analog de substrate β-galactosidase a th' ann an IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside), a tha gu math furasta a bhrosnachadh. Fo bhrosnachadh IPTG, faodaidh an brosnaichear co-thàthadh a chruthachadh leis a' phròtain bacaidh, agus mar sin thèid cumadh a' phròtain bacaidh atharrachadh, gus nach gabh a chur còmhla ris a' ghine targaid, agus thèid an gine targaid a chur an cèill gu h-èifeachdach. Mar sin ciamar a bu chòir dùmhlachd IPTG a dhearbhadh rè an deuchainn? An e as motha 's ann as fheàrr?
An toiseach, tuigidh sinn prionnsabal inntrigeadh IPTG: Tha trì ginean structarail, Z, Y, agus A, ann an operon (eileamaid) lactose E. coli, a bhios a’ còdachadh β-galactosidase, permease, agus acetyltransferase, fa leth. Bidh lacZ a’ hydrolysis lactose gu glùcois agus galactose, no gu allo-lactose; bidh lacY a’ leigeil le lactose san àrainneachd a dhol tron membran cealla agus a’ dol a-steach don chill; bidh lacA a’ gluasad a’ bhuidheann acetyl bho acetyl-CoA gu β-galactoside, a tha a’ toirt a-steach toirt air falbh buaidh puinnseanta. A bharrachd air an sin, tha sreath obrachaidh O ann, sreath tòiseachaidh P agus gine riaghlaidh I. Tha còd gine I na phròtain casg a dh’ fhaodas ceangal ri suidheachadh O den t-sreath obrachaidh, gus am bi an operon (meta) air a chumail fodha agus air a chuir dheth. Tha làrach ceangail ann cuideachd airson làrach ceangail pròtain gnìomhaiche gine catabolic - CAP suas an sruth bhon t-sreath tòiseachaidh P. Tha an sreath P, sreath O agus làrach ceangail CAP còmhla a’ dèanamh suas roinn riaghlaidh an operon lac. Tha na ginean còdaidh aig na trì enzyman air an riaghladh leis an aon roinn riaghlaidh gus an cur an cèill gu co-òrdanaichte de thoraidhean gine.
Nuair a tha lactos an làthair, tha an operon lac (meta) ann an staid casg. Aig an àm seo, bidh an casg-bhacadh lac a tha air a chur an cèill leis an t-sreath I fo smachd sreath brosnachaidh PI a’ ceangal ris an t-sreath O, a chuireas casg air RNA polymerase bho bhith a’ ceangal ris an t-sreath P agus a chuireas bacadh air tòiseachadh tar-sgrìobhaidh; nuair a tha lactos an làthair, faodar an operon lac (meta) a bhrosnachadh. Anns an t-siostam operon (meta) seo, chan e lactos fhèin an fhìor bhrosnaichear. Bidh lactos a’ dol a-steach don chill agus air a chatalachadh le β-galactosidase gus a thionndadh gu allolactose. Bidh am fear mu dheireadh, mar mholaciul brosnachaidh, a’ ceangal ris a’ phròtain casg-bhacadh agus ag atharrachadh cumadh a’ phròtain, a tha a’ leantainn gu dealachadh a’ phròtain casg-bhacadh bhon t-sreath O agus tar-sgrìobhadh. Tha an aon bhuaidh aig isopropylthiogalactoside (IPTG) ri allolactose. Tha e na bhrosnaichear glè chumhachdach, nach eil air a mheatabolachadh le bacteria agus a tha glè sheasmhach, agus mar sin tha e air a chleachdadh gu farsaing ann an deuchainn-lannan.
Ciamar a dh’aithnicheas tu an dùmhlachd as fheàrr de IPTG? Gabh E. coli mar eisimpleir.
Chaidh an seòrsa E. coli BL21, a chaidh a leasachadh gu ginteil, anns an robh am pGEX ath-chuingealaichte dearbhach (CGRP/msCT) a chur ann am meadhan leaghaidh LB anns an robh 50μg·mL-1 Amp, agus a chur ann am fàs thar oidhche aig 37°C. Chaidh an cultar gu h-àrd a chur ann an 10 botail de mheadhan leaghaidh LB ùr 50mL anns an robh 50μg·mL-1 Amp aig co-mheas de 1:100 airson cultar leudachaidh, agus nuair a bha an luach OD600 eadar 0.6 agus 0.8, chaidh IPTG a chur ris an dùmhlachd mu dheireadh. Tha e 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Às dèidh inntrigeadh aig an aon teòthachd agus aig an aon àm, chaidh 1 mL den fhuasgladh bacterial a thoirt bhuaithe, agus chaidh na ceallan bacterial a chruinneachadh le bhith gan cur fo shnìomh-chriathrag agus an cur fo SDS-PAGE gus buaidh diofar dùmhlachdan IPTG air abairt pròtain a sgrùdadh, agus an uairsin an dùmhlachd IPTG leis an abairt pròtain as motha a thaghadh.
Às dèidh deuchainnean, gheibhear a-mach nach eil dùmhlachd IPTG cho mòr 's as urrainn. Tha seo air sgàth gu bheil puinnseanta sònraichte aig IPTG do bacteria. Ma thèid barrachd air an dùmhlachd a chur ris, marbhaidh sin an cealla cuideachd; agus san fharsaingeachd, tha sinn an dòchas, mar as motha de phròtain a tha so-sgaoilte a thèid a chur an cèill anns a' chill, 's ann as fheàrr, ach ann an iomadh cùis nuair a bhios dùmhlachd IPTG ro àrd, thèid mòran de phròtain a chruthachadh. Anns a' bhodhaig, ach lùghdaichear an ìre de phròtain a tha so-sgaoilte. Mar sin, gu tric chan e an dùmhlachd IPTG as freagarraiche, mar as motha 's ann as fheàrr, ach mar as ìsle an dùmhlachd.
Is e adhbhar inntrigeadh agus àiteachadh shreathan innleadaichte gu ginteil toradh a’ phròtain targaid a mheudachadh agus cosgaisean a lughdachadh. Chan e a-mhàin gu bheil buaidh aig factaran a’ ghnè fhèin agus am plasmid abairt air abairt a’ ghine targaid, ach cuideachd le suidheachaidhean taobh a-muigh eile, leithid dùmhlachd an neach-brosnachaidh, teòthachd an inntrigidh agus an ùine inntrigidh. Mar sin, san fharsaingeachd, mus tèid pròtain neo-aithnichte a chur an cèill agus a ghlanadh, is fheàrr an ùine inntrigidh, an teòthachd agus dùmhlachd IPTG a sgrùdadh gus na suidheachaidhean iomchaidh a thaghadh agus na toraidhean deuchainneach as fheàrr fhaighinn.
Àm postaidh: 31 Dùbhlachd 2021